Genomics, Proteomics & Bioinformatics（GPB）（JCR和中科院分区1区，五年平均影响因子11.1）近期在线发表了由3044永利集团张永清教授、中国科学院昆明动物研究所王国栋研究员课题组合作完成的题为"High Mutation Rates in Non-human Primates Edited by Cytosine Base Editors"的研究论文。
要点介绍
研究问题：
基因编辑动物的生产和应用正呈爆发式增长，但其全基因组范围的突变率在很大程度上仍属未知。当前关于CBE编辑动物脱靶突变的研究结论存在分歧：部分研究认为CBE编辑的猴和犬中未检测到显著差异，而另一些研究则在小鼠和水稻中检测到数百个单碱基脱靶突变（single-nucleotide variant，SNV）。研究报道的不一致性究竟是源于数据分析流程的差异，还是CBE在不同物种间脱靶效应本身存在区别？厘清这一问题，对于评估CBE技术在转化医学中的安全性具有重要意义
研究方法：
本研究基于公开获取的亲代-子代家系（parent-offspring trio）全基因组测序数据，采用统一的标准化分析流程（Platypus变异检测+等位基因频率20%-100%过滤+深度过滤），对108个基因编辑和野生型动物家系（涵盖猴、犬和小鼠）进行系统性新发突变（de novo mutation，DNM）鉴定，并进一步分析了突变类型、突变谱、目标序列上下游序列、突变率及功能注释。
主要结果：
1. 每个CBE编辑的猴家系中平均检出3,980个DNM，远高于未编辑对照组的平均值29个；CBE编辑猴的突变率升高约158倍，而CBE编辑小鼠仅升高约4倍。
2. CBE编辑猴中99.3%的新发突变（DNM）为C>T/G>A突变，且突变位点5'和3'端呈现T碱基富集的序列特征，符合胞嘧啶脱氨酶的酶学特性。
3. 不同CBE编辑猴个体间的DNM重叠极少，同一猴不同组织间的DNM亦仅呈现部分重叠，提示CBE在猴胚胎多细胞阶段持续发挥随机脱氨作用。
4. SpCas9编辑的动物（猴、狗和小鼠）与未编辑对照相比，突变率未见显著变化。
研究背景
基因编辑技术，尤其是CRISPR-Cas系统及其衍生的碱基编辑器，正在深刻推动生物医学研究与临床应用的变革。CBE能够在不引入DNA双链断裂的前提下实现C/G到T/A的精准转换，目前CBE编辑产品已进入临床试验阶段？？。然而，关于CBE全基因组范围的脱靶效应，现有研究结论并不一致：在小鼠和水稻中检测到大量脱靶SNV，而在猴和狗中却未见显著差异。这种矛盾可能源于不同研究采用了差异化的数据分析流程和过滤标准：不同的分析流程可能导致截然不同的结论，而过于宽松的过滤标准会引入大量假阳性，过于严格的标准则可能遗漏真实的脱靶事件。
针对上述挑战，本研究系统比较了四种变异检测工具（GATK、Platypus、FreeBayes、Strelka2）的性能，综合考虑检出率、假阳性率和假阴性率等指标，最终选定Platypus作为家系DNM检测的最优工具。同时，结合基因编辑效率和测序准确率，设定了DNM过滤的参数标准，建立了一套标准化、统一且适用于基因编辑动物家系的数据分析流程。在此基础上，研究进一步分析了基因编辑动物的突变类型、突变谱、目标序列上下文、突变率及功能注释，重点解析了CBE在非人灵长类中的脱靶风险及其潜在影响，为评估CBE在人类疾病治疗中的安全性提供了重要参考。
结果展示
1. CBE编辑猴中新发SNV急剧增加
本研究在建立标准化分析流程的基础上，对108个基因编辑及野生型动物家系（包括猴、狗和小鼠）进行了系统性DNM鉴定。结果表明，每个CBE编辑猴家系平均含有3,980个新发SNV，远高于未编辑对照组的平均值29个。在小鼠中，CBE编辑组平均215个SNV，对照组为44个，与既往GOTI方法报道的结果一致。相比之下，CBE编辑猴和小鼠中新发插入/缺失突变（indel）均未发生明显变化。
图1 CBE编辑猴中新发 SNV急剧增加
2. 突变类型与序列特征反映CBE的酶学特征
突变类型分析显示，CBE编辑猴中99.3%的SNV为C>T/G>A转换，这一比例远超自发突变谱中C>T的预期。此外，C>A/G>T和C>G/G>C突变也显著增加。目标序列上下文分析表明，突变位点5'和3'端呈现明显的T碱基偏好，与APOBEC1脱氨酶的底物偏好高度一致。突变谱分析显示，CBE编辑动物的突变谱与未编辑对照截然不同——C>T突变从对照组的数十个小峰，一跃成为占据绝对主导的高峰，而其他突变类型则被"稀释"至近乎消失。上述特征明确指向CBE的脱氨酶活性，而非自发突变。
图2 CBE编辑动物新发SNV的突变谱与序列上下文特征
3. 跨物种基因编辑动物突变率比较
基于亲代-子代全基因组测序数据估算的突变率显示，BE4max编辑猴的平均突变率为8.35×10⁻⁷，较未编辑对照（5.26×10⁻⁹）升高约158倍；BE4编辑小鼠的突变率为4.30×10⁻⁸，较对照（8.94×10⁻⁹）升高约4倍。SpCas9编辑的猴、犬和小鼠与各自对照相比，突变率均无显著差异，排除了CRISPR系统本身（DNA双链断裂）对基因组稳定性的影响。该物种差异可能源于猴长达约160天的妊娠期（小鼠仅约20天），延长了CBE脱氨酶的暴露窗口；此外，不同CBE版本、物种特异的DNA修复通路、表观基因组特征和细胞内环境等因素也可能参与调控脱靶事件的频率和分布。
图3 不同基因编辑动物突变率的比较
4. 脱靶SNV的潜在危害
功能注释分析揭示了CBE编辑猴中脱靶突变的潜在危害。平均每个CBE编辑家系含有35个非同义突变，其中22个被预测为有害突变，显著高于未编辑对照（0.24个）和BE4编辑小鼠（0.89个）。这些有害突变分布于202个脱靶基因，其中8个基因与靶标基因参与相同的信号通路。尤其值得关注的是，脱靶基因LMNB1与靶标基因LMNA同属Lamin蛋白家族，其突变可能导致与LMNA突变相似的表型，从而严重干扰突变动物的表型分析。
图4 CBE编辑猴的脱靶突变中存在大量有害突变
总结与展望
本研究通过严苛的分析流程，首次揭示了CBE编辑非人灵长类动物中惊人的高突变率，并证实这些突变具有CBE特异的酶学特征。这一发现与此前关于CBE编辑猴中的研究报道不吻合，从而进一步凸显了分析方法在脱靶评估中的关键作用。本研究还表明，SpCas9编辑并未显著增加突变率，提示脱靶风险主要来自碱基编辑器的脱氨酶活性，而非SpCas9的DNA切割。
鉴于非人灵长类与人类基因组的高度保守性，以及CBE已在人类细胞临床试验中应用的现状，本研究建议：CBE编辑细胞治疗在进入临床前，必须开展全面的全基因组脱靶分析。此外，考虑到物种间在发育时间、DNA修复通路和表观遗传环境等方面的差异，在模式动物（如小鼠）中获得的安全性数据可能无法直接外推至人类，灵长类模型在碱基编辑安全性评估中具有不可替代的价值。
（初审：李爱涛 终审：黄裕钊）
